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Fiche 15 : GRAM (coloration de Brown et Brenn)

Technique

Déparaffinage • Placer les coupes sur un portoir horizontal et verser 1 ml d’une solution aqueuse à 1% de cristal violet, puis 5 gouttes d’une solution aqueuse à 5% de bicarbonate de sodium. Laisser agir 1 minute en agitant doucement les lames.

Laver à l’eau courante.

• Mettre sur la lame une solution de Lugol * et laisser agir pendant 1 min.

Rincer à l’eau courante et sécher les lames dans du papier filtre.

• Différencier par un mélange Alcool-éther (ou Acétone-Ether) à parties égales jusqu’à disparition de la coloration bleue. • Rincer à l’eau distillée. • Colorer les lames avec une solution de Fuchsine basique * pendant 1 minute

Rincer à l’eau courante et sécher les lames dans du papier filtre

• Plonger les lames dans l’Acétone • Différencier par une solution d’acide picrique à 0,1% dans l’acétone jusqu’à ce que les coupes prennent une teinte rose jaunâtre (environ 30 secondes) • Rincer rapidement dans de l’acétone puis dans un mélange acétone-xylène à parties égales

Passer dans deux bains successifs de Toluène Montage

Résultats

Bactéries Gram positif : bleues Bactéries Gram négatif : rouges Noyaux : rouges

Réactifs

Solution de Lugol : dissoudre

iodure de potassium 2 g eau distillée 200 ml puis iode 1 g

Solution de Fuchsine-basique

Solution-mère : C’est une solution aqueuse saturée (0,25 %) de Fuchsine-basique Solution de travail : extemporanément diluée : solution-mère 0,1 ml eau distillée 100 ml

Remarque

Colore surtout bien les germes positifs.

 

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