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Fiche 5 : COUPE, MICROTOMIE

La confection des coupes nécessite un microtome muni d’un rasoir dont la manipulation et l’entretien doivent être conduits avec soin. Il permet l’obtention de rubans de paraffine dans lesquels un ou plusieurs échantillons sont choisis et étalés sur lame.

Les microtomes

En technique courante on utilise le microtome type « Minot » dont il existe autant de variétés que de fabricants.

-  Microtomes rotatifs à mouvement vertical La pièce se déplace de haut en bas et est attaquée par un rasoir maintenu fixe dans une position verticale, fil en haut. Le bloc est mu par un volant et se déplace verticalement devant le rasoir. Ils sont utilisés pour les coupes incluses en paraffine.

-  Microtomes linéaires à mouvement horizontal Dans ce cas soit la pièce soit le rasoir se déplace sur une glissière horizontale. Ils sont plutôt utilisés pour les coupes à la celloïdine ou pour celles qui ont subi une double inclusion ainsi que pour les blocs de paraffine de grande taille.

-  Microtomes pour examens extemporanés Cette dernière catégorie est de conception très simple : la pièce est fixée sur une platine et a une avance verticale, le rasoir venant à la rencontre du bloc suivant un mouvement en arc de cercle. C’est l’utilisateur qui imprime le mouvement et la vitesse du rasoir. Ces microtomes sont plutôt remplacés maintenant par les cryostats.

-  Cryostat C’est un microtome dans un congélateur à - 20° permettant des coupes de tissu frais congelé.

Le microtome doit être nettoyé régulièrement avec un solvant organique de type toluène ou xylène et graissé avec une huile neutre fluide (huile pour machine à coudre).

Les pièces à graisser sont :
-  le palier du volant,
-  la coulisse du chariot horizontal et le coulisseau,
-  les glissières du chariot vertical.

Avec de la vaseline seront enduites :
-  la vis micrométrique,
-  la rotule de la pince du porte-objet et,
-  les surfaces d’appui du support de rasoir.

Les rasoirs de microtome

Deux types de rasoirs sont possibles :
-  les lames « jetables », solution idéale, mais qui suppose la possibilité d’approvisionnement régulier. Elles sont glissées dans un porte-lames qui se fixe dans la mâchoire du microtome.
-  des rasoirs de 100 à 350 mm de long, qui peuvent être ffûtés par le personnel du laboratoire. Il en existe 3 variétés :
-  biplans, pour les tissus durs,
-  plans concaves, pour tous tissus,
-  biconcaves, pour les tissus mous.

L’affûtage

Matériel nécessaire :
-  gouttière,
-  plaque de verre,
-  abrasif spécial (grains très fins),
-  « Argentil » ou produit équivalent,
-  cuir rond rembourré à une seule face et monté sur un support pour lames larges ou cuir de Zimmer à 4 faces pour lames étroites,
-  papier journal monté sur un rouleau de bois (facultatif).

Mode d’emploi

-  Insérer d’abord le rasoir dans une gouttière à affûtage, sorte de cylindre métallique ouvert sur un côté dans lequel se glisse le dos du rasoir. La gouttière indique l’angle d’affûtage.

-  Effacer les imperfections des petites brèches sur la plaque de verre sur laquelle on dépose un peu d’abrasif mélangé à un peu d’Argentil ou équivalent ou même un peu d’essence ou d’huile. Passer le rasoir sur la plaque de verre, fil en avant, obliquement (l’angle formé par le rasoir et l’axe de la plaque de verre étant d’environ 30°), en appuyant et bien à plat. Le mouvement doit se faire d’abord d’arrière en avant pour une face, puis, en retournant le rasoir, d’avant en arrière pour l’autre face, de telle sorte qu’à chaque passage toute la longueur du fil « frotte » sur la plus grande partie de la longueur de la plaque. La durée de cette opération varie selon l’importance des imperfections : de 10 à 30 min. ou plus. Remettre de l’Argentil et/ou de l’abrasif si nécessaire. Essuyer ensuite le rasoir avec un chiffon et examiner la qualité de son fil au microscope.

-  Faire le fil sur le cuir, puis éventuellement sur un rouleau de papier journal, dos de la gouttière en avant, fil du rasoir en arrière.

Le rasoir doit être impeccablement affûté et entretenu quotidiennement. Le fil du rasoir doit être examiné régulièrement au microscope. Un affûtage industriel doit être pratiqué lorsque le fil est trop abîmé.

L’affûtage est une question d’expérience et ne s’acquiert qu’après une longue pratique.

L’entretien du rasoir consiste d’abord à l’essuyer avec un tissu doux.

NB : Il existe actuellement des machines qui exécutent l’affûtage des rasoirs de façon automatique.

Il existe surtout des lames de rasoir « jetables » qui permettent de faire aisément des coupes de 3-4 m et demandent à être fixées dans un porte-lames-jetable qui se fixe dans la mâchoire du microtome. L’utilisation de telles lames évite tous ces gestes.

L’insertion du bloc de paraffine sur le porte-objet du microtome doit être solide :

-  le bloc, après un léger chauffage, doit être maintenu fermement sur le porte-objet des modèles anciens, puis immergé dans l’eau froide afin d’avoir une meilleure adhérence...

-  s’il s’agit d’un bloc sur socle plastique, il est fixé dans la pince du porte-objet, pour les microtomes récents.

La confection des coupes

Matériel

Le matériel indispensable à la bonne exécution du travail consiste en :

-  un bain-marie dont la température de l’eau doit être de 10° au dessous du point de fusion de la paraffine. L’adjonction d’une petite quantité d’alcool ou de détergent permet de réduire la tension superficielle et de mieux déplisser les coupes recueillies à sa surface et montées sur lame de verre.

-  ou une platine chauffante qui permet, comme le bain-marie, de défriper les coupes sur les lames de verre.

-  une solution d’albumine glycérinée qui permet de « coller » les coupes sur les lames de verre. La solution la plus simple consiste à mélanger 50 ml de blanc d’œuf frais avec 50 ml de glycérine, de filtrer sur plusieurs épaisseurs de gaze, puis d’ajouter un cristal de thymol pour éviter la prolifération bactérienne. Cette solution sera gardée au réfrigérateur. Elle peut être achetée toute préparée (Biolyon, réf. : 28001).

-  un bistouri et des aiguilles lancéolées, qui servent à séparer les coupes les unes des autres à partir du ruban et à étirer la coupe afin d’éviter les plis lors de l’étalement sur lame.

-  des lames de verre porte-objet dont les dimensions classiques sont de 76 x 25 mm, l’épaisseur variant de 1 à 1,2 mm. De « grandes » lames permettent d’étudier des pièces de grande taille. Certaines lames présentent une plage dépolie permettant d’inscrire le numéro avec un crayon à mine. Les stylos-feutre ou à bille sont proscrits car l’alcool dissout leur encre. Si les lames n’ont pas de plage dépolie, il faut graver les coordonnées avec une pointe de diamant directement sur la lame.

-  une étuve pour sécher les coupes afin qu’elles ne se décollent pas. La température de l’étuve doit être légèrement inférieure au point de fusion de la paraffine afin de bien faire adhérer la coupe, en général à 56°. Pour les tissus plus délicats, tel que le tissu cérébral, la température ne doit pas dépasser 37°, mais le temps de séchage sera de 24 heures.

-  un système réfrigérant : les blocs de paraffine se coupent mieux lorsqu’ils sont froids : soit cristallisoir rempli de glaçons, soit plaques que l’ont met à refroidir dans le congélateur ou plaques réfrigérantes électriques.

NB : Dans les pays chauds, il convient de programmer la découpe des blocs de paraffine tôt le matin, avant que la température extérieure ne soit trop élevée et de refroidir les blocs pendant au moins une heure au réfrigérateur avant la coupe.

Il faut veiller aussi à ce que les appareils climatiseurs éventuels ne fassent pas s’envoler les rubans qui viennent d’être confectionnés. Pour cela la direction des flux doit passer loin de la zone où la découpe a lieu.

Technique de coupe

Comme pour toute technique, l’expérience d’un « ancien » est la meilleure façon d’apprendre les gestes nécessaires à la bonne exécution des coupes, à la fois en ce qui concerne l’organisation et la technique.

-  position : l’utilisateur la choisit là où il se sent le mieux, généralement assis face au microtome, les autres instruments utiles étant placés à proximité.

-  angle du rasoir : il doit être réglé à 3 à 5°, ce qui donne de bons résultats pour des blocs d’une consistance moyenne. Incliner un peu plus le rasoir si la coupe est difficile. Ex : tissus mous.

-  dégrossissage du bloc :il est d’abord nécessaire, pour obtenir la totalité de la surface du prélèvement inclus en paraffine, de dégrossir le bloc.

Cette étape peut se faire avec un rasoir plus usagé. A chaque tour de manivelle du microtome, le bloc est avancé vers le rasoir d’une épaisseur de 15 m environ, jusqu’à ce que l’on obtienne la section adéquate à examiner.

Le dégrossissage terminé, le rasoir est changé et l’épaisseur de coupe souhaitée est affichée sur le microtome (en général entre 3 et 5 m pour la plupart des tissus et jusqu’à 7 m pour la neuropathologie).

Il est alors souhaitable de mettre la tranche de section dans l’eau ou sur une surface froide afin de refroidir de la même façon le tissu inclus et la paraffine et de leur donner la même consistance, ce qui améliore la qualité des coupes. Le ramollissement du tissu dans l’eau facilite déjà grandement la confection du ruban...

Dès l’apparition des premières coupes sur le plat du rasoir, l’extrémité du ruban est saisie et, par une légère traction, le ruban de paraffine est tiré à chaque passage du bloc devant le rasoir.

Le ruban formé par la succession de coupes peut être disposé entre deux feuilles de papier Joseph sur lequel a été noté au crayon le numéro de la coupe. Il peut être conservé au réfrigérateur pour d’éventuelles colorations spéciales ou immunohistochimiques.

La coupe sélectionnée est détachée du ruban avec le bistouri (ou les aiguilles lancéolées) et étalée sur une lame porte-objets préalablement indicée du numéro d’ordre (avec une mine de plomb ou gravé). Selon les habitudes du laboratoire :

-  soit la coupe est directement étalée sur la lame recouverte d’une goutte d’albumine glycérinée et défripée avec les aiguilles lancéolées.

-  soit les coupes sont mises sur le bain-marie où elles se défripent d’elles-mêmes par l’action de la chaleur en 30 secondes environ. Une légère traction sur les bords par les aiguilles lancéolées permet au besoin de les défriper. La coupe sélectionnée est déposée sur une lame et l’eau résiduelle est éliminée.

Les coupes sont placées dans une étuve dont la température est légèrement inférieure au point de fusion de la paraffine, pendant au moins 30 minutes. Si le tissu est particulièrement fragile, les coupes sont séchées dans une étuve à 37° pendant toute une nuit. Les coupes peuvent alors être colorées.

Les coupes blanches peuvent être stockées dans des boîtes à l’abri de la poussière, en évitant les rayures (les emballer dans du papier Joseph une à une si elles doivent être conservées dans des tiroirs de lames standards).

 

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