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Fiche 4 : INCLUSION, IMPREGNATION, ENROBAGE

Entre la fixation et l’enrobage en paraffine plusieurs étapes sont nécessaires

-  La déshydratation car l’eau et la paraffine ne sont pas miscibles. Elle doit être progressive, par des alcools à 60, 80, 95 et 100° alcool absolu, afin que les fluides se substituent les uns aux autres jusqu’à l’imprégnation dans la paraffine. L’alcool utilisé en technique courante est l’alcool éthylique. Il peut être dénaturé par du méthanol ou de l’alcool isopropylique afin de le rendre impropre à la consommation et de réduire les coûts de fonctionnement. Il est possible également pour les premiers postes d’utiliser des alcools recyclés.

-  Un éclaircissement doit être fait par du Xylène, Toluène ou Méthylcyclohexane (MCH), l’alcool et la paraffine n’étant pas miscibles. Ce dernier est moins toxique que le Toluène ou le Xylène. Le Benzène, plus toxique, doit être proscrit.

L’imprégnation en paraffine

Elle s’effectue dans une paraffine maintenue à l’état liquide par un séjour dans une étuve dont la température est réglée légèrement au-dessus de son point de fusion. Lorsque l’imprégnation est complète, la pièce est retirée et placée dans un bain de paraffine que l’on fait durcir à la température du laboratoire : on obtient ainsi un bloc prêt à être coupé.

Le choix de la dureté de la paraffine dépend souvent des conditions de la température ambiante : en général, c’est une paraffine à point de fusion de 56 à 58°C. qui est utilisée.

Dans des laboratoires très chauffés et également dans les pays tropicaux, on emploiera une paraffine à point de fusion plus élevé, toute température d’inclusion supérieure à 85°C étant cependant à éviter en raison d’artefacts subsidiaires dus à la chaleur pouvant se produire dans l’objet.

Certains histologistes ajoutent à la paraffine une certaine quantité (5 à 10% voire 20%) de cire d’abeille, qui améliore la consistance du bloc et permet aux sections de mieux adhérer entre elles, d’où une confection plus aisée des rubans.

La paraffine à l’état neuf se coupe bien plus difficilement que celle maintenue pendant un certain temps à la chaleur régulée par thermostat ou celle utilisée à plusieurs reprises (évaporation des composants gazeux contenus dans la paraffine). Il est donc conseillé de préparer une quantité assez importante de paraffine de réserve, qui sera chauffée pendant environ 5 minutes (pour la rendre plus souple et non friable), filtrée et conservée sous thermostat.

Le filtrage de la paraffine fraîche ou déjà utilisée est extrêmement important car il permet de se débarrasser définitivement de tous les dépôts d’impuretés susceptibles d’entraîner à la coupe la détérioration du rasoir ou l’altération du ruban. Certaines paraffines contenant du D.M.S.O. (Diméthyl-sulfoxyde) ne doivent pas être chauffées au dessus de 62°, afin de ne pas dénaturer cet additif qui permet une meilleure infiltration. La qualité des coupes est en grande partie fonction de l’absence de toute trace de solvant dans la paraffine de la coupe : ce résultat est obtenu par la pratique des bains multiples de paraffine, la pièce étant passée dans au moins 3 bains successifs avant le coulage du bloc. Ces bains doivent être fréquemment changés car ils se chargent progressivement de solvants ; le dernier bain doit toujours être constitué de paraffine vierge. La persistance de toluène ou de tout autre agent clarifiant abaisse le point de fusion de la paraffine, rendant donc celle-ci plus molle et moins propre à la coupe et entraîne une dessiccation (par évaporation du solvant) et une rétraction des structures, réalisant l’aspect « cuit » caractéristique des inclusions défectueuses.

La durée de l’imprégnation varie suivant le volume des pièces. Elle est en moyenne de 6 heures au total pour des pièces assez petites, mais est souvent portée sans inconvénients à 24 heures. Un séjour prolongé dans la paraffine fondue n’est guère préjudiciable aux structures tissulaires à condition que la température de l’étuve ne dépasse jamais 56 à 58° ; l’exacte régulation de cette température est donc une condition fondamentale d’une bonne inclusion.

Des « automates d’inclusion » permettent de mieux réguler ces différents temps. Les plus modernes, sous vide, permettent une inclusion beaucoup plus rapide et de bonne qualité. Ils sont chers.

La « mise » en blocs

Une fois les pièces imprégnées de paraffine, il faut les inclure dans un bloc de paraffine afin de permettre la coupe au microtome. C’est l’enrobage qui peut se faire manuellement ou à l’aide d’une « station d’enrobage ».

Pour cela on peut utiliser :
-  des barres de Leuckhardt, pièces métalliques en forme de L que l’on pose sur une surface plane et que l’on rapproche plus ou moins selon la dimension de la pièce, ou

-  des moules, petites boîtes que l’on peut fabriquer soi-même en diverses matières, papier ou étain ou actuellement plastique. Un peu de paraffine est d’abord coulée, qui va se figer au fond, puis le fragment est délicatement posé, la surface à couper étant posée contre le fond du moule. Un complément de paraffine est alors versé.

Le numéro d’identification doit être porté sur une paroi soit en le gravant, soit en incluant une étiquette en papier, soit en l’inscrivant sur le socle de certaines cassettes en plastique.

Le refroidissement de cette paraffine amène sa solidification en un bloc prêt à être coupé. Ce refroidissement est généralement obtenu en laissant reposer la paraffine à la température du laboratoire.

Ce procédé, le plus pratique, entraîne une certaine rétraction du bloc.

Il est utile, pour remédier à cet inconvénient, de plonger le bloc dans de l’eau froide dès qu’une fine pellicule solide s’est formée en surface.

La finition du bloc

Si l’on ne dispose pas de cassettes d’inclusion, le bloc, après refroidissement et démoulage, doit être retaillé afin de nécessiter un minimum de dégrossissage au microtome et permettre une coupe plus aisée. Le surplus de paraffine sera récupéré et réutilisé dans le premier bain.

Des platines chauffantes ou réfrigérantes, des distributeurs de paraffine chaude, de véritables « stations d’enrobage », ou groupes thermo-électriques, facilitent la tâche de l’utilisateur et économisent la paraffine en standardisant la taille des blocs ce qui permet une meilleure préhension et un rangement plus facile dans les archives.

D’autres méthodes d’inclusion sont possibles

-  Inclusion en paraplast (mélange de paraffines purifiées et de polymères plastiques) qui possède de grandes qualités de résistance et d’élasticité. L’inclusion des pièces dans ce mélange est conseillé. Il permet la confection de coupes très fines de tissus durs ou de consistances différentes, avec des résultats d’excellente qualité.

-  Méthode d’inclusion particulière, la celloïdine nécessite une infrastructure particulière car il s’agit d’un mélange explosif (solution dans un mélange d’éther et d’éthanol). Elle permet une imprégnation des tissus à froid, sans chauffage. Mais c’est une méthode lente (plusieurs semaines sont nécessaires pour inclure correctement une pièce de dimensions moyennes), et certaines étapes sont de réalisation délicate... Sa consistance autorise des coupes de grandes dimensions (utérus, sein...) et surtout d’encéphale dans les laboratoires de neuropathologie.

-  Double inclusion en celloïdine et en paraffine. Cette méthode comporte certains avantages de la célloïdine (maintien correct de tissus durs et de consistances variées, possibilité de grandes coupes) et de la paraffine (rapidité, coupes fines...).

 

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