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fiche 3a : FIXATION

Ne sera traitée ici que la fixation pour la microscopie optique

« La fixation est une opération destinée à tuer les cellules en les conservant, autant que possible, en l’état où elles se trouvaient pendant la vie. Faute de fixation, il y a risque d’autolyse... Les meilleurs fixateurs sont ceux qui, tout en agissant rapidement, produisent le moins possible de modifications secondaires ou d’artifices susceptibles de donner une idée très fausse de la morphologie interne des cellules. » (M. Langeron, 1949)

Il existe 2 variétés de fixateurs :

-  ceux qui pénètrent rapidement et fixent lentement, comme le Formol,
-  ceux qui pénètrent lentement et fixent rapidement comme le Bouin.

Aussi, le Formol convient mieux aux grosses pièces alors que le Bouin convient aux petites pièces. Actuellement c’est l’Alcool-Formol Acétique (AFA) qui est utilisé pour les petites pièces.

La « bonne » fixation doit éviter des écueils :

-  pour les grosses pièces, la fixation sera insuffisante si elles sont plongées dans une quantité insuffisante de liquide, ou pendant trop peu de temps, ou sans avoir été disséquées ou recoupées en tranches de 1 ou 2 cm permettant une mise en contact plus rapide du fixateur avec les tissus profonds ; ou lorsqu’elles ont été plongées dans un fixateur rapide et peu pénétrant, le centre n’étant alors pas fixé alors que la surface l’est trop.

-  Les biopsies de petite taille deviendront surfixées si l’acheminement au laboratoire a été trop long. Si le délai d’acheminement est supérieur à 24 heures, c’est le formol qui devra être utilisé quelle que soit la taille du prélèvement.

-  Pour les tissus fragiles, comme le foie, le ganglion... une bonne fixation ne peut se faire que sur des tranches fines (1 à 2 mm d’épaisseur) qui souvent ne peuvent être obtenues que sur des fragments durcis par quelques heures de fixation. Ces problèmes ne se posent que s’il s’agit de biopsies chirurgicales et non de biopsies à l’aiguille !

Règles générales

-  En dehors des micro-biopsies, il est indispensable, avant toute fixation, de mesurer et, éventuellement, de peser et photographier la pièce.

-  Si la pièce est importante, il faut l’entailler (selon une procédure liée au type de pièce) afin que le fixateur pénètre mieux.

-  La quantité de fixateur doit être suffisante, au moins 2/3 de liquide fixateur pour 1/3 de volume de pièce.

-  Le fixateur doit être placé en premier dans le récipient afin que la pièce ne « colle » pas à ses parois. L’embouchure doit être suffisamment large pour qu’on ne soit pas obligé de casser le récipient pour sortir la pièce ! Le flacon doit être immédiatement étiqueté (n° et/ou nom du patient sur le flacon et non sur le couvercle).

-  Pour les micro-biopsies, il est souvent utile de colorer légèrement le liquide fixateur (1 goutte d’éosine ou de bleu de toluidine à 0,1 %, par exemple) afin de mieux visualiser le fragment. Celui-ci sera si possible placé sur le fond mouillé d’une cassette, un seul fragment étant posé dans chaque cassette (si 3 petits fragments cylindriques : 3 cassettes !)

Dans tous les cas où cela est possible, la pièce doit être convenablement orientée avant toute fixation avec des repères sous forme de fils colorés, ou mieux, placée sur une planche de polystyrène topographiée.

Les différents fixateurs

Fixateurs à base de formaldehyde

  • A - Formol Neutre à 10% :

Le « formol pur » correspond en fait à la solution aqueuse de formaldehyde à 40%, vendue dans le commerce sous la dénomination de « formol. » La solution à utiliser doit être encore diluée à 10% : on obtient un formol à 5%.

Indications
-  Toute l’histologie de routine
-  Les grosses pièces en première intention (les entailler auparavant)
-  Etude des lipides en histochimie

Préparation

Formol « pur » du commerce10 ml
Eau distillée 90 ml
Carbonate de Calcium * 1 g

* Le carbonate de calcium sert à neutraliser le formol, c’est-à-dire évite la formation d’acide formique en en diminuant le pH.

Conservation : plusieurs mois

Temps réel de fixation : il est variable en fonction de la quantité de matériel à fixer, habituellement un à deux jours.

Après fixation : on peut, si nécessaire, éliminer le pigment formolique sur coupe par immersion, pendant 5 min., dans un mélange d’alcool ammoniacal (alcool ammoniacal à 28 % = 5 ml, alcool à 70° = 100 ml).

  • A’ - Formol Nacl.

De composition très simple

Formol pur du commerce 13 ml
NaCl 0,9 gr
Eau distillée 87 ml

NB1 : la solution de formol utilisée comme fixateur est donc obtenue par dilution à 10% de la solution aqueuse de formaldehyde à 40% considérée comme formol « pur. »

NB2 : beaucoup de défauts imputés au formol proviennent le plus souvent de la trop grande taille des pièces plongées dans le fixateur, d’où l’impérieuse nécessité de recoupes préalables. Autre inconvénient de tout fixateur aqueux, la lenteur de fixation des tissus adipeux (sein).

  • B - Liquide de Bouin aqueux

Indications
-  Toute l’histologie de routine (il convient moins bien que le Formol pour certains examens histochimiques ultérieurs).
-  Il est utilisé en première intention pour les petits prélèvements (moins de 1 cm3) ou en deuxième intention après une première fixation formolée.

Préparation

Liquide de Bouin fortfaible
Formol « pur » du commerce25 ml 10 ml
Acide picrique à saturation dans l’eau *75 ml50 ml
Acide acétique glacial5 ml5 ml
Eau distillé0 ml35 ml

* Il est bon d’avoir toujours au laboratoire une réserve d’acide picrique à saturation dans l’eau

Conservation : quelques mois

Temps réel de fixation :
-  Fragment de moins de 2 mm3 : de 2 à 3 heures.
-  Fragment supérieur à 1 cm3 : habituellement 1 jusqu’à 3 jours.

NB : Du fait de la présence d’un acide (acide picrique) le liquide de Bouin a un léger pouvoir décalcifiant.

Après fixation : on déshydrate directement dans les alcools.

  • C - Liquide de Bouin Alcoolique (Dubosq Brasil)

Indications : il complète le Bouin par ses qualités très pénétrantes.

Préparation

Alcool à 80° 150 ml
Formol « pur » du commerce60 ml
Acide acétique glacial15 ml
Acide picrique1 g

NB : Il peut être utile d’avoir une provision de solution d’acide picrique dans l’alcool à 80° . C’est un fixateur très pénétrant.

Temps réel de fixation : De 1 à 3 jours, puis plonger directement dans l’alcool à 90°. Les très petites pièces (1mm d’épaisseur) peuvent être fixées en 30 min.

  • D - Liquide de Bouin Hollande

Indications
-  Toute l’histologie de routine.
-  En première intention pour les organes lymphoïdes et -hématopoïétiques.
-  Pour les petits prélèvements de moins de 1 cm3.
-  C’est un fixateur rapide excellent.

Préparation

Formol du commerce 10 ml
Acide picrique 4 g
Acide acétique glacial1,5 g
Acétate neutre de cuivre2,5 g
Eau distillée100 ml

Protocole
-  Dissoudre à froid au mortier l’acétate de cuivre dans l’eau distillée.
-  Ajouter l’acide picrique en remuant.
-  Après dissolution ajouter le formol et l’acide acétique glacial.

Conservation : quelques mois.

Temps réel de fixation : comme le Bouin.

Après fixation : déshydrater directement dans les alcools sans passer par la phase aqueuse.

Autres Fixateurs

Alcool-Formol-Acetique (A.F.A.) très intéressant (commercialisé par Carlo-Erba)

-  Indications : tous tissus, petits fragments

-  Préparation

Formol « pur » du commerce 20 ml
Acide acétique glacial 50 ml
Alcool éthylique absolu 750 ml
Eau distillée 180 ml

Conservation : excellente

Temps réel de fixation : 24 heures

Après fixation : passage direct dans les alcools.

Alternative : la concentration de Formol pur peut être augmentée de 20 à 100 ml/litre

Remarque : Les fixateurs contenant de l’acide acétique assurent une meilleure coloration nucléaire.

Fixateurs à base de Chlorure de Zinc

Permettent à la fois une bonne morphologie et la conservation d’une majorité d’épitopes nécessaires à l’immuno marquage sur tissu inclus en parrafine

Solution faible

Formol « pur » du commerce 130 ml
Acide acétique glacial 5 ml
Chlorure de zinc 10 g
Eau distillée 860 ml

Conservation  : excellente

Temps réel de fixation  : 24 heures au moins

Après fixation  : passage direct dans les alcools.

Alternative : Formol NaCl Zinc

Formol pur du commerce130 ml
NaCl9 gr
Chlorure de Zinc10 gr
Eau distillée870 ml

Formol alcool Zinc

Formol pur du commerce130 ml
Acide acétique 50 ml
Alcool absolu750 ml
Chlorure de Zinc 10 gr
Eau distillée150 ml

La concentration de Chlorure de Zinc peut variée de 10 gr/litre à 50 gr.litre. Les petits fragments peuvent être fixés rapidement (2 heures), les plus larges 24 heures et au-delà.

 

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